בספטמבר 1928 חזר פלמינג מחופשה, ומצא שבאחת מצלחות החיידקים שהשאיר צמח עובש — ומסביבו החיידקים מתו. הוא שם לב, חקר וקרא לחומר ״פניצילין״, על שם העובש. זו דוגמה קלאסית לתגלית שנולדה ״במקרה״ — אבל רק כי פלמינג עצר ושאל למה.
פלמינג לא הצליח לטהר את החומר ולייצר ממנו תרופה בכמות. את זה עשו כעשר שנים מאוחר יותר הווארד פלורי, ארנסט צ׳יין ונורמן היטלי באוקספורד. ב־1945 זכו פלמינג, פלורי וצ׳יין יחד בפרס נובל. פלמינג עצמו הזהיר כבר אז ששימוש לא נכון באנטיביוטיקה יגרום לחיידקים להתחסן בפניה.