לפי ספר במדבר, במסע במדבר הלויים היו אחראים לפרק את המשכן, לשאת את חלקיו ולהקים אותו מחדש. כל משפחה של לויים קיבלה תפקיד משלה. בבית המקדש, לפי ספר דברי הימים, הלויים שרו ונגנו, שמרו על השערים ועזרו לכוהנים.
הכוהנים הם קבוצה מתוך הלויים: צאצאיו של אהרן, אחי משה, שגם הוא היה משבט לוי. כלומר, כל כוהן הוא גם לוי, אבל לא כל לוי הוא כוהן. במקום נחלה, קיבלו הלויים ערים מפוזרות בכל הארץ, ובהן גם ערי המקלט.
גם היום יש משפחות שעל פי המסורת הן מצאצאי הלויים, ושמות משפחה כמו ״לוי״ ו״הלוי״ נפוצים. בבית הכנסת, בקריאת התורה, עולה קודם כוהן ואחריו לוי. משה, אהרן ומרים היו בני שבט לוי.