המסדר התחיל כקבוצה שהפעילה בית חולים ואכסניה לעולי רגל נוצרים בירושלים, ובתחילת המאה ה־12 קיבל הכרה רשמית מהאפיפיור. עם הזמן נעשו ההוספיטלרים לכוח צבאי חזק, ששמר על מבצרים ועל דרכים. הסמל שלהם היה צלב לבן על רקע שחור או אדום.
בעכו הקימו מתחם ענק, שאת חלקו אפשר לבקר היום בשם ״אולמות האבירים״. הם בנו גם את כוכב הירדן והחזיקו במבצרים נוספים. אחרי נפילת עכו בשנת 1291 עברו לקפריסין, אחר כך לרודוס ולבסוף למלטה, ולכן הם ידועים גם כ״אבירי מלטה״. גם היום קיים ארגון בשם הזה, שעוסק בעזרה רפואית והומניטרית.